牛结核分支杆菌检测试剂盒检验方法

　　牛结核分支杆菌检测试剂盒检验方法
1. 试剂准备（试剂准备区）
（1）从冰箱中取出试剂盒, 从试剂盒中取出实验所需试剂，充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体。
（2）核算当次实验所需要的反应数（n），并根据如下表所示反应体系计算当次实验所需要的各种试剂量。
n =阴性对照数（1T）+阳性对照数（1T）+误差预留量（1T）+样本数
单反液配制表(每份)
PCR反应液
17.5 μL
混合酶液（Taq酶+UNG酶）
2.5 μL
(3)在无菌离心管中加入上述试剂，充分混匀后瞬时离心。按照20 μL/管分装量将试剂分装至PCR反应管。
(4)盖紧PCR反应管盖后将PCR反应管转移至样本处理区。剩余试剂放回-20℃以下冰箱冷冻保存。
2.样本准备（样本处理区）
用QIAGEN、Roche公司提取试剂盒提取DNA，具体操作按照其试剂盒说明书操作。
3.加样
在上述制备好的PCR反应样本管中分别加入处理好的待测标本DNA各5μl、终体积25μl/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上。阴性对照和阳性对照管则各加5μL试剂盒自带的阴性对照或阳性对照品，终体积为25μl/管，盖好PCR反应盖混匀后瞬时低速离心，转移到PCR仪器上。
4.PCR（PCR扩增区）
（1）取样本处理区准备好的PCR反应管，放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置，并记录放置顺序。
（2）按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行PCR扩增。
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